Taxonomía multifásica de hongos endófitos del orden hypocreales en rubiaceae de bosque natural de Costa Rica - Escudero Leyva, Efraín (2023)
Los problemas fitosanitarios relacionados al café en Latinoamérica y otras áreas en el mundo, han registrado un aumento en la frecuencia y la severidad de las enfermedades producidas por hongos como Hemileia vastatrix ó Mycena citricolor. Los hongos endófitos son importantes simbiontes de plantas, conocidos por tener un amplio rango de papeles ecológicos, habitando los tejidos internos sin causar efectos negativos aparentes o inmediatos en la salud del hospedero. Basados en la hipótesis de que los hongos endófitos aislados de bosques prístinos pueden conferir protección a las plagas a través de diferentes mecanismos, el presente trabajo comprende el aislamiento de hongos endófitos de plantas silvestres de Rubiaceae de áreas naturales de Costa Rica para probarlos contra patógenos que afectan al café. Se presentó un protocolo para analizar datos ITS fúngicos, desde el preprocesamiento de calidad de secuencias hasta la clasificación taxonómica, asignación de rasgos funcionales y análisis filogenético, clasificando 1400 aislamientos de hongos endófitos de Rubiaceae silvestre en aproximadamente 800 especies. Para comenzar a generar una alternativa verde para el control de M. citricolor, se seleccionaron los hongos endófitos Daldinia eschscholzii GU11N, Nectria pseudotrichia GUHN1, Purpureocillium aff. lilacinum CT24, Sarocladium aff. kiliense CT25, Trichoderma rifaii CT5, T. aff crassum G1C, T. aff. atroviride G7T, T. aff. strigosellum GU12 y Xylaria multiplex GU14T. Los aislamientos de Trichoderma spp. produjeron los mayores porcentajes de inhibición del crecimiento in vitro. Posteriormente, se verificó la colonización endofítica, seguida de ensayos de promoción y antagonismo del crecimiento in planta, demostrando que Trichoderma CT5 y G1C tienen potencial para promover el crecimiento de las plantas y antagonizar contra M. citricolor, reduciendo la incidencia, la severidad y previniendo la mortalidad de las plantas. Estos dos aislamientos posteriormente mostraron tolerancia a fungicidas, obteniendo que CT5 tiene capacidad de remoción de hasta 89% para clorotalonil, 46,4% para ciproconazol y 33,1% para trifloxistrobina. En el caso de la azoxistrobina, la mayor remoción (82,2%) se produjo por adsorción a la biomasa fúngica, al mismo tiempo que detoxifica la matriz acuosa. Posteriormente, se compararon los perfiles volátiles de GU11N con y sin la presencia del patógeno M. citricolor mediante ensayos sin contacto y de cultivo dual, utilizando métodos de GC-MS-HS-SPME y UHPLC-HRMS/MS para identificar compuestos no volátiles de extractos orgánicos de los micelios involucrados en la interacción. Los resultados mostraron más compuestos volátiles usando HS-SPME (39 componentes) que con la técnica HS (13 componentes), compartiendo solo 12 compuestos. Las pruebas estadísticas sugirieron que D. eschscholtzii inhibe el crecimiento de M. citricolor a través de la liberación de COVs que contienen una combinación de 1,8-dimetoxinaftaleno y compuestos terpénicos afectando las estructuras reproductivas del patógeno, por lo que se corroboraron los efectos nocivos del 1,8-dimetoxinaftaleno en una prueba in vitro confirmando el daño estructural con fotografías SEM. Los datos de UHPLC-HRMS/MS, revelaron un predominio de derivados de ácidos grasos entre los compuestos identificados. Como parte del estudio de las plantas de Rubiaceae de donde provenían los endófitos, se desarrolló un flujo de trabajo de alto rendimiento para identificar diversos fitoquímicos. El estudio de metabolitos secundarios se realizó en hojas de una variedad comercial de café y dos especies silvestres de Rubiaceae, siendo la cafeína, la trigonelina y la teobromina muy abundantes en las hojas de café, mientras que las moléculas relacionadas con la defensa química, como los fenilpropanoides, el ácido giberélico y el monolignol sinaldehído se encontraron más abundantemente en las hojas silvestres de Rubiaceae. Finalmente, se colaboró integrando datos taxonómicos y metabolómicos a la plataforma MicrobeMASST, una herramienta de búsqueda de espectrometría de masas con información taxonómica altamente curada para la anotación de metabolitos microbianos en experimentos de metabolómica no dirigidos. Esta plataforma contiene 60 000 monocultivos microbianos, permitiendo buscar espectros de MS/MS conocidos y desconocidos y vincularlos con sus respectivos productores microbianos a través de patrones de fragmentación de MS/MS.