Desarrollo de un ensayo inmunoenzimatico (ELISA) para el diagnóstico de Paragonimus mexicanus - Zúniga Moya, María José (2023)
La paragonimiasis es una zoonosis parasitaria transmitida por alimentos y ocasionada por trematodos del género Paragonimus. La enfermedad es considerada un serio problema de salud pública en áreas endémicas. Costa Rica se considera región endémica para Paragonimus mexicanus. Debido a que en Latinoamérica no se encuentra disponible una prueba diagnóstica inmunológica el objetivo del presente estudio fue determinar la secuencia parcial de cisteínas proteasas (CP) de P. mexicanus, a partir de ARN total, aislado de metacercarias y formas adultas del parásito, para producir una CP recombinante, caracterizarla y estandarizar una prueba inmunoenzimática (ELISA) para el diagnóstico de la paragonimiasis. En la primera parte del trabajo se identificaron a partir de la secuenciación de 16 clones diez nuevas secuencias de CPs, diferentes a todas las reportadas previamente en bases de datos públicas a nivel mundial. Se subclonó, expresó y purificó una CP recombinante de 23 kDa de P. mexicanus (PmCP), la cual presentó alto grado de similitud con la CP6 de Paragonimus kellicotti. La PmCP6 recombinante fue utilizada como antígeno en Western blot, y se evaluaron sueros de humanos positivos a Paragonimus westermani, P. mexicanus, Fasciola spp., Schistosoma spp., Clonorchis sp., Taenia solium, Toxocara canis, Toxocara spp., Spirometra erinaceieuropaei, Leishmania spp., Entamoeba histolytica y sueros negativos a parasitosis. Los sueros positivos a P. westermani y P. mexicanus reaccionaron con la proteína de 23 kDa, formando una banda. La proteína no fue detectada por los sueros positivos a otras parasitosis, tampoco los sueros negativos detectaron la proteína, concluyéndose que PmCP6 es específica para ser utilizada en el diagnóstico serológico. Para la estandarización del ELISA se utilizaron 39 sueros positivos a P. mexicanus y Paragonimus westermani, 33 sueros positivos a otras parasitosis (fascioliasis, esquistosomiasis, clonorchiasis, cisticercosis, toxocariasis, leishmaniosis, esparganosis y amebiasis) y 140 sueros de pacientes sanos. El ELISA se estandarizó utilizando 0,125 μg/100μl del antígeno PmCP6, bloqueando la placa con leche descremada al 10%, diluyendo los sueros 1:100 y utilizando el conjugado en una dilución de 1:40.000. La sensibilidad y especificidad del ensayo fue 92,3% y 95,7%, respectivamente, se determinaron reacciones cruzadas con C. sinensis (4/8), Spirometra (3/5) y E. histolytica (2/5). Esta es la primera vez que se reporta el uso de una cisteína proteasa específica de P. mexicanus en una técnica inmunoenzimática. Se recomienda utilizarla en el sistema salud para confirmar infecciones ectópicas de paragonimiasis.